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ctDNA甲基化检测技术

技术原理

我们首先要明白什么叫DNA甲基化。

我们通常讲的DNA甲基化，就是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMTs)的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体将胞嘧啶核苷酸（C）第5位碳原子甲基化变为5’-甲基胞嘧啶（5’-mC）的一种反应。它是表观遗传学最重要的一个修饰，广泛存在于动植物等真核生物基因组里面，被誉为“第五碱基”。

简单来讲，在基因组四种碱基ATGC中，C在DNA甲基化转移酶的作用下变成5mC，这就是基因组中存在的DNA甲基化的修饰，而这种修饰会改变基因组的物理和生物学的功能。其中5mC的重要性不可小觑，它广泛参与胚胎发育、细胞分化、基因组稳定性维持、基因调控及各种疾病等方面，具有重要的临床医学应用价值。因此，5mC被誉为“第五碱基”。

肿瘤癌症之所以死亡率那么高，是因为最开始我们察觉不到异样，那些癌细胞都非常安静，并且缺乏早期检测手段，而等到我们检测到癌症时，它已经变大，或是说已经扩散到身体各个器官上了，这时已经错过了最佳的治疗时间。所以要想提高得癌症的生存率，只有通过早期发现、早期诊断和早期治疗措施等来实现。目前许多研究表明，DNA甲基化与多种肿瘤的发生和发展有着密切的关系。在肿瘤发生发展的过程中，DNA甲基化修饰异常扮演着重要的角色。了解DNA甲基化修饰异常在肿瘤发生发展中的机制，将有助于癌症的早期发现、早期诊断、早期治疗并改善预后。

ctDNA甲基化及临床应用

ctDNA（circulating tumor DNA），即循环肿瘤DNA，指的是癌细胞或肿瘤组织细胞，经过细胞的凋亡、坏死或分泌产生的DNA片段，并会释放到血液循环系统中去，因此它会包含着原生体肿瘤细胞基因组一定的突变信息(点突变、indel、CNV、融合等)、修饰信息(甲基化5m、羟甲基 化5hmC等)，以及结构信息(片段长度、断裂特征等)。cfDNA（circulating-free cell DNA），又称总循环DNA，是指存在于血浆或血清的细胞外的DNA，所以ctDNA是cfDNA的一部分 ，且体内ctDNA的含量不到cfDNA的1%。健康人群中大部分cfDNA的长度在70～200bp，但肿瘤患者的ctDNA长度会大于200bp甚至超过1000bp。大量的研究表明，在肿瘤形成早期，血液中就开始有了ctDNA的存在，因此检测到ctDNA对早期发现肿瘤、早期诊断、治疗和善后都有着重大的意义。

之前提到，DNA甲基化修饰在肿瘤早筛、早诊等方面，具有独特的应用价值，ctDNA更是如此：1）ctDNA甲基化具有组织特异性和肿瘤特异性，可以溯源，所以一旦在血浆中的ctDNA中发现甲基化的变异，我们可以去溯源它是来自于哪个器官组织的；2）ctDNA甲基化会有稳定的biomarker，便于检测；3）ctDNA甲基化检测的灵敏度要比突变检测的灵敏度更高。所以ctDNA在临床方面有三大应用：1）指导抗肿瘤精准用药；2）疗效评估和预后判断；3）肿瘤的早期发现和诊断。

ctDNA样本准备事项

ctDNA是动态的，是有半衰期的。在人体内，随着肿瘤组织细胞处于不断的凋亡、坏死和分泌过程，ctDNA会不断地进去到血液循环或者说是血浆中，而在血浆里核酸酶的作用下，ctDNA会不断降解消失，以此来维持一定的动态和半衰期；而在人体外，ctDNA在抽血后会继续降解，来自外周血细胞的cfDNA会持续进入血浆中，导致ctDNA含量逐渐减少，会降低其检测信号。所以：

一、 采用大口径针头（<=21）抽取血液样本，通常5-10ml，微小残留疾病（MRD，指患者在治疗完全缓解后体内残留微量癌细胞的状态）最多需要60ml，并使用K2EDTA或Streck cfDNA采血管收集；

二、 参考NIPT标准要求，尽快进行血浆分离，K2EDTA(4-6小时内，4℃以下)，Streck采血管(2-7天内，10-30℃)：低速1600g离心分离10min，后高速16000g离心分离10min，分离后的血浆过滤并立即冷冻存放(-80℃)，并使用干冰运输。

以此阻止ctDNA的进一步降解，抑制外周血细胞的cfDNA释放到血浆里，保持ctDNA检测信号的稳定性。

ctDNA甲基化检测技术参考案例

案例1: 血浆DNA甲基化分析EBV病毒相关疾病的病因：

Methylation analysis of plasma DNA informs etiologies of Epstein-Barr virus-associated diseases. Nat Commun. 2019;10(1):3256

本研究通过对鼻咽癌（NPC，N=15）、EBV相关性淋巴癌（N=9）和传染性单核细胞增多症患者（N=5）的血浆里游离的cfDNA进行WGBS测序分析，就是用4ml血浆里的DNA全部用于bisulfite sequencing(cfDNA BS-seq， WGBS)，发现EBV DNA甲基化图谱呈现疾病相关模式。这表明在鼻烟癌诊断中进行血浆EBV DNA甲基化分析具有重要的潜力。

     图像为EBV相关疾病的特异性EBV DNA甲基化聚类图，可以把鼻咽癌还是非鼻咽癌区分开。

基于靶向测序分析血浆EBV病毒DNA的甲基化、病毒拷贝数以及片段大小

使用技术：液相探针杂交捕获：罗氏NimbleGen的SeqCap Epi甲基化富集系统，可以对bisulfite处理后的模块进行富集。

案例2: 证实血液中ctDNA甲基化检测技术能够提前发现肿瘤信号

Non-invasive early detection of cancer four years before conventional diagnosis using a blood test Nat Commun. 2020 Jul 21;11(1):3475.

泰州队列的部分血液样本进行的长期和系统的癌症早期检测研究

     复旦大学科研团队发现通过血液ctDNA甲基化的检测，可以在提前4年发现肿瘤的信号，能够起到早发现早筛查的作用。

     检测技术用到的是PanSeer技术，从训练集和测试集中可以看到，在一定的特异性的角度下，检测灵敏度是非常不错的。PanSeer技术是基于多重PCR扩增富集595个区域共计11787个CpG位点的高深度靶向亚硫酸盐测序（Targeted Bisulfite Sequencing，TBS）。

案例3: ctDNA甲基化biomarker用于肝癌诊断和预后

Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. Nat Mater. 2017;16(11):1155-1161.

使用TCGA数据库通过比较肝癌组织和正常血白细胞筛选出401个肝癌特异性甲基化Biomarker，通过靶向亚硫酸盐测序（Targeted Bisulfite Sequencing，TBS）在1933例样本（1,098名HCC患者和835名正常对照）血浆中验证，构建了诊断检测模型，该模型显示出较高的诊断特异性和敏感性（P <0.001），并与肿瘤负荷，治疗反应和分期高度相关；分别筛选出10个和8个甲基化Biomarker用于HCC诊断和预后。

案例4: ctDNA甲基化Biomarker用于肠癌早期诊断和预后

Circulating Tumor DNA Methylation Profiles Enable Early Diagnosis, Prognosis Prediction, and Screening for Colorectal Cancer. Sci Transl Med. 2020;12(524):eaax7533

     首先通过将CRC组织与正常血液白细胞进行比较来确定CRC特异性甲基化特征。然后，应用了机器学习算法，使用来自801名CRC患者和1021名正常对照人群的无细胞DNA（cfDNA）样本，开发了预测性诊断和预后模型。获得的诊断预测模型可将CRC患者与正常对照以较高的准确度进行区分（曲线下面积= 0.96）。预后预测模型还可以有效预测CRC患者的预后和生存率（P <0.001）。此外，我们使用无监督聚类方法生成了基于ctDNA的CRC分子分类，并获得了两个亚组的CRC患者，这些亚组的总生存期明显不同（在验证队列中P = 0.011）。最后，在一项前瞻性队列研究中发现，单个ctDNA甲基化标记物cg10673833在检测1493名高危人群中的CRC和癌前病变方面可产生高灵敏度（89.7％）和特异性（86.8％）

ctDNA甲基化检测技术方案的小结：

     对于cfDNA进行亚硫酸盐测序是一个系统流程, 包括样本处理、血浆cfDNA提取、亚硫酸盐转化及文库 构建等。对于实验技术要求较高。特别是针对基于多重PCR捕获的TBS测序，具有非常高的技术壁垒.

如何准确地筛选和验证ctDNA甲基化的Biomarker？

     正常情况下，样本为正常人和癌症患者，取样正常人的血浆，并取样癌症患者的血浆和肿瘤组织。理想情况下，具有肿瘤特异性的CpG位点或基因发生甲基化或高甲基化（比如乳腺癌的BRCA1甲基化，肺癌的SHOX2甲基化），并被释放到血浆cfDNA中；与此同时，血浆中来自外周血细胞的cfDNA不发生甲基化或发生低甲基化，此时这个基因就是我们理想中的肿瘤甲基化Biomarker。

ctDNA甲基化生物信息分析

ctDNA甲基化研究方案：

方案1: 直接对血浆cfDNA进行测序

建立特定人群的正常人cfDNA甲基化基线，后寻找不同肿瘤ctDNA的特异性甲基化的biomarker，构建预测模型；

样本需求量大，需要投入大量专业研究，不断积累数据，意义重大。

方案2: 特定癌症组织进行筛选Biomarker+血浆cfDNA测序

进行特定肿瘤及临床特征的早筛早诊和预后检测；

对癌症、对照（癌旁组织或良性组织）、外周血（PBMC）筛选特异性甲基化biomarker，再进行血浆cfDNA验证和评估特异性及灵敏度。

方案3: TCGA数据库+血浆cfDNA测序

直接用TCGA数据库，针对较为普遍的癌症疾病，进行数据库的整理挖掘，形成候选的特异性甲基化biomarker，再进行血浆cfDNA验证和评估特异性及灵敏度。

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